Paul Sérusier naît à Paris dans un milieu aisé. Son père, François Sérusier, est un parfumeur qui dirige la société des parfums Houbigant. Paul fréquente le lycée Condorcet à partir de 1875 et y fait de brillantes études, obtenant en 1882 un baccalauréat de philosophie et en 1883 un baccalauréat de mathématiques. En 1885, il intègre l’ecole de peinture et de sculpture : l'Académie Julian.

Sérusier passe l'été de 1888 en famille à Pont-Aven et y rencontre des artistes, parmi lesquels Paul Gauguin qui influence immédiatement Sérusier. Revenu à Paris avec un tableau inspiré par Gauguin, il transmet son enthousiasme à ses condisciples de l'Académie Julian. Le tableau est baptisé Le Talisman.

Au cours de l'été 1889, Sérusier revient à Pont-Aven et constitue, avec Pierre Bonnard, Maurice Denis, Henri-Gabriel Ibels et Paul-Elie Ranson le groupe des Nabis (nabi signifie prophète en hébreu). Ce groupe a des préoccupations spiritualistes. Il s'intéresse à l'orphisme (doctrine de la Grèce antique fondée sur le mythe d'Orphée) ou à la théosophie (syncrétisme religieux selon lequel toutes les religions recèlent une part de vérité). Le groupe des Nabis sera rejoint ensuite par d'autres artistes comme Édouard Vuillard, mais il ne durera qu'une dizaine d'années. La dispersion a lieu vers 1900.

Dans les années 1890, Sérusier s'installe chaque été en Bretagne, d'abord au Huelgoat, puis à Châteauneuf-du-Faou avec l'actrice polonaise Gabriella Zapolska (1857-1921). Il passe ses hivers à Paris où il expose régulièrement, en particulier aux expositions Impressionnistes et Symbolistes.

En 1902, il est confronté à une dépression profonde. A partir de 1908, il commence à enseigner la théorie de l'art à l'académie Ranson, à Paris. Cette académie est une école, fondée par le peintre nabi Paul-Elie Ranson (1864-1909), qui fonctionnera jusqu'à 1955. L'une des élèves de Paul Sérusier, Marguerite-Gabrielle Claude, devient son épouse en 1912. 

A partir de 1917, le peintre vit principalement à Châteauneuf-du Faou avec son épouse. En 1921, il publie un ABC de la peinture, un court traité théorique sur le dessin et la peinture, mémoire de toutes ses recherches esthétiques.

Paul Sérusier continue à exposer régulièrement jusqu'à sa mort en 1927. Son épouse Marguerite, elle-même peintre, lui survivra jusqu'à 1950 et se consacrera beaucoup à faire connaître l'œuvre de son mari.